广东海洋大学研究生，广东海洋大学研究生院
花色苷是浆果、水果、蔬菜、块茎中大量含有的天然水溶性色素，具有降糖、抗炎、抗氧化等多种生物活性。但花色苷的化学性质极不稳定，很容易受到加工条件、pH值、光、温度和氧气的影响而发生降解，且在体内的生物利用度不高，极大限制了其在食品工业上的应用。
在课题组前期研究的基础上，广东海洋大学食品科技学院的滕慧、陈雷*等以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）为对象，选择常用且安全的已作为食品添加剂使用的肉桂酸甲酯作为酰基供体，以安全且有特异性的南吡啶为溶剂介质，在减压环境中通过Novozym 435脂肪酶进行酯交换反应，促使肉桂酰花色苷生成。利用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用对半制备色谱纯化得到的单一产物肉桂酰C3G进行结构鉴定，研究肉桂酸酰化对C3G热稳定性、亲脂性和抗氧化活性的影响，为酰化花色苷在食品产业中的综合应用提供科学依据。
1、酶法合成酰化花色苷产物分析
由图1A可知，520 nm波长下，除了保留时间13 min处存在反应物C3G的峰外，21.5 min处出现了一个新的峰，说明有新的花色苷衍生物生成且保留时间靠后。根据C 18 反向色谱柱的原理可以判断新的花色苷衍生物的极性比C3G低。Liu Jingnan等的研究称酰基嫁接至花色苷会降低花色苷的极性；因此推断21.5 min处的物质可能为酰化后的新产物酰化C3G。由HPLC-MS对此进行分析，确认后对酰化C3G进行分离和纯化工作。实验测得花色苷酰化转化率为80%。
此外，由图1B可知，280 nm波长下，除了C3G和酰化C3G的出峰时间外，在28、29 min和37 min等处也出现了吸收峰，说明酰化反应后的产物中存在杂质。
2、半制备色谱纯化酰化C3G分析
如图2所示，酰化花色苷的出峰时间为27～28.3 min处，峰形对称；520 nm和280 nm波长下均可观察到酰化花色苷的吸收峰与其他物质的吸收峰分离效果良好，说明半制备液相色谱使酰化C3G与各物质有效分离开。收集27～28.3 min处馏出液即得酰化C3G纯化物。酰化C3G纯化物的HPLC图谱如图3所示，计算得到酰化C3G纯化物的纯度为98.3%。
如图4A、B所示，MS图谱中出现一个m/z 579的分子离子峰[M+H]，为一个肉桂酸酰基（m/z 147）和一个C3G（m/z 449）失去羟基后的分子质量之和，表明酰化反应生成的是一个单酰化C3G。在MS/MS图谱中，出现了一个m/z 287的离子碎片，m/z 287为脱去葡萄糖苷的C3G分子质量；随着MS/MS图谱中诱导碰撞解离的增强，m/z 287的离子碎片逐渐增多，而没有其他离子碎片出现，这一方面说明了C3G母核稳定性强，另一方面说明酰化发生在葡萄糖苷上。
3、酰化花色苷亲脂性分析和热降解动力学分析
由图5可知，pH 3时，不同温度条件下（60、75、90 ℃），C3G和C3(6C)G的热降解随着温度的升高而加快，说明花色苷对热表现出不稳定的特性。根据-ln（C t /C 0 ）与加热时间进行线性回归，如表1所示，线性关系良好，相关系数（R）均大于0.97，酰基化修饰前后花色苷热降解均符合动力学一级反应规律，符合Arrhenius公式。
由表1可知，酰化前后的花色苷随着温度和pH值的升高，k值都随之变大，t 1/2 明显下降，这表明花色苷类物质不稳定，对温度和pH值敏感，在高温高pH值环境中分解更快。肉桂酰修饰后的产物C3(6C)G同修饰前相比，相同pH值和温度下，k值降低，t 1/2 增加2 倍以上（除pH 3、90 ℃），说明肉桂酸酰基化修饰花色苷可以显著提高花色苷的稳定性，有利于色素的应用及保存。
由表2可知，C3G和C3(6C)G在不同pH值下的E a 值会随着pH值的增大而变大。这表明加热过程中，随着pH值增加酰化前后花色苷的降解速率对温度的依赖越大，即在高pH值环境中升高相同的温度，受热降解速率的提升比低pH值环境中更为显著。相同pH值下，C3(6C)G的E a 值均高于C3G，表明酰化修饰使花色苷被热处理时对温度变化更为敏感。
4、酰化花色苷抗氧化能力分析
如图6A所示，选定浓度下，C3G的DPPH自由基清除率在28.93%～84.11%之间，C3(6C)G的DPPH自由基清除率在33.81%～87.26%之间，均显示出较强的DPPH自由基清除能力，并且随着浓度升高可观察到明显差异。此外，同种浓度下，VC的DPPH自由基清除率显著大于C3(6C)G和C3G（P＜0.05）；C3(6C)G的DPPH自由基清除率大于C3G，两者仅在200 μmol/L浓度下差异显著（P＜0.05），在其余浓度下并不显著（P＞0.05）。
由图6B可知，相同浓度下，FRAP从大到小依次为：C3G＞C3(6C)G＞VC。C3G与酰化C3G的抗氧化能力在高浓度下（200 μmol/L）差异不显著（P＞0.05）。因此，C3G和C3(6C)G作为抗氧化剂，具有较强FRAP活性。总体来说，酰基化依然保留了较强的还原能力。
由图6C可知，C3G、C3(6C)G和VC在选定浓度下的ABTS阳离子自由基清除率与DPPH自由基清除的结果相似：随着浓度升高，三者的ABTS阳离子自由基清除率均明显提高，且在高浓度下均显示出强ABTS阳离子自由基清除能力。C3G的ABTS阳离子自由基清除率在10.22%～46.5%之间，C3(6C)G在10.76%～46.9%之间，均显著低于相同浓度下VC的自由基清除率（P＜0.05）；仅在80 μmol/L浓度下C3(6C)G的ABTS阳离子自由基清除率显著高于C3G（P＜0.05），其余浓度下，C3(6C)G略强于C3G，但差异不显著（P＞0.05）。
由图6D可知，样品的羟自由基清除率展示了与上述3 种抗氧化性结果不同的趋势：80、110 μmol/L浓度下，C3(6C)G的羟自由基清除能力显著大于C3G和VC（P＜0.05），在高浓度200 μmol/L下效果更显著。有研究表明，虽然提供肉桂酰供体的肉桂酸本身并无羟自由基清除能力，但肉桂酸衍生后产物具有羟自由基清除能力。
结论
运用减压生物酶法，可催化肉桂酸甲酯和C3G发生酰化反应，合成酰化产物，酰化转化率可达到80%。用高效液相色谱分析酰化后产物的成分，利用半制备高效液相仪对酰化后的产物进行分离纯化，产物纯度达98.3%。经由MS分析可知酰化产物为肉桂酰单酰化产物：C3(6C)G。酰基化修饰后C3G的亲脂性和不同pH值及温度下的热稳定性均明显提高。通过DPPH自由基清除、ABTS阳离子自由基清除、FRAP、羟自由基清除体外实验测定不同浓度下C3G、C3(6C)G和VC的抗氧化能力。与相同浓度的VC相比，除了在ABTS阳离子自由基清除实验中能力较弱外，在其余3 种抗氧化实验中表现良好。羟自由基清除结果显示，酰化后的C3G在高浓度下（200 μmol/L）羟自由基清除能力显著增强，这表明C3G被肉桂酰修饰后并没有减弱其抗氧化性能，反而在羟自由基清除能力上显著提高。这些结果表明，肉桂酰修饰是改善C3G脂溶性、稳定性和抗氧化性的有效方法。本研究通过安全绿色的方法将C3G转化为C3(6C)G，不仅拓展了花色苷的应用范围，还为酰化花色苷的高效制备提供了一条有效途径。
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通信作者简介
陈雷，男，博士生导师，现任广东海洋大学食品科技学院教授，主要研究领域包括植物化学物质、海洋营养物质和微量营养素的生物利用度，重点研究天然小分子类药物的吸收和代谢机制。兼职担任Food Frontiers (SCI) 副主编, Food Science and Human Wellness (IF: 8.022/Q1) 期刊编委。参与组织2020、2021和2022年 “医药与食品中的植物化学物质国际（ISMPF）”会议，担任“国际食物营养与安全协会”秘书。以第一或通讯作者发表的SCI论文100余篇，其中一区论文66篇，IF>10的12篇，ESI前1%高被引论文7篇，热点论文（hot paper）2篇，论文总被引3000余次，H-index 35，撰写英文专著2部，入选2021年“全球前10万名科学家”榜单。主持国家自然科学基金面上项目、青年基金等课题，参与国家/省部级课题10余项。
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第一作者简介
滕慧，副教授，广东海洋大学食品科学学院，博士毕业于庆北大学（韩国）食品生物技术专业，2015.08-2021.06年任职于福建农林大学食品科学学院，2021年至今任职于广东海洋大学食品科技学院。主要从事小浆果中花色苷等天然色素成分研究，不断深入探索提高花色苷稳定性和生物利用度的有效途径。构建了“生物活性物质纯化与鉴定技术体系”、“生物活性物质功能筛选与评价技术体系”和“功能因子作用机制研究技术体系”等三大技术体系， 先后获国家自然科学基金青年项目（基于疏水作用力的酪蛋白/花色苷纳米球的构建及其吸收增效机制，27万元）， 福建省面上基金项目（覆盆子花色苷的酶促酰化修饰及其衍生物的稳定性研究，8万元），中国博士后基金面上项目（酰基化修饰花色苷对鸡胸肉中杂环胺的抑制作用及机理，8万元）资助。现任Journal of Advanced Research on Botany主编及Journal of Toxicology Research 责任编辑。SCI 收录论文103篇（含录用），H-index 29，引用2208次，论文单篇最高被引292 次，近3年（2019-至今），以第一/通讯作者发表论文57篇，JCR一区32篇，IF>10.0的12篇，7篇入选ESI数据库高被引论文，2篇热点论文；受邀参编英文专著2部，授权发明专利5件。
本文《酰基稳态化花色苷的制备及其热降解特性和抗氧化活性》来源于《食品科学》2023年44卷6期49-56页，作者：滕慧，米亚妮，何远菊，邓宏挺，艾超，陈雷。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220705-044。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
图片来源于文章原文及摄图网。
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、宁夏大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院、黄山学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
广东海洋大学研究生(广东海洋大学研究生院)