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硒是维持机体健康必需的微量元素，摄入适量的硒有利于保护免疫系统、心血管系统、甲状腺功能、生育功能及抗氧化功能等。机体自身无法合成硒元素，只能从外界摄入，但人类日常饮食中硒含量较低，难以满足普通人群尤其是缺硒地区人群的补硒需求。
铅作为一种有害重金属元素，通过食物及饮用水、空气及皮肤接触等途径在人体内富集，主要分布在大脑、肾脏、肝脏及骨骼等器官中。已有研究表明，硒不仅能够影响铅的吸收，还能对铅诱导的机体炎症损伤和免疫系统紊乱产生显著拮抗作用。
杏鲍菇是我国工厂化大规模种植的一种食用菌，富含蛋白质、多糖等营养成分，其栽培不受土壤因素限制，培养周期短，并且杏鲍菇对微量元素有较好的吸收能力，因此相较于大米、小麦等谷物，杏鲍菇是一种理想的硒生物强化载体。目前对杏鲍菇富硒蛋白（SePEP）的营养、结构特性及其铅毒性缓解作用鲜有报道。南京农业大学食品科学技术学院的张雪莉、胡秋辉*等以SePEP为原料，分析蛋白中硒含量、形态和氨基酸，并测定蛋白的结构以评估硒积累对杏鲍菇蛋白营养和结构特性的影响。此外，通过体外模拟消化SePEP和细胞实验探究SePEP对Pb2+诱导的RAW264.7细胞损伤和炎症反应的影响，旨在为SePEP缓解铅毒性作用机理研究及SePEP功能食品开发提供理论参考。
1、SePEP的硒含量及硒形态分析
通过HPLC-ICP-MS测定SePEP的硒形态，由图2A可知，SePEP中主要包括SeCys2、MeSeCys和SeMet。通过对3 种硒化合物含量及其中硒含量计算可得，SePEP中SeCys2、MeSeCys、SeMet含量分别为（413.28±6.66）、（103.39±2.54）mg/kg和（356.87±4.75）mg/kg，3 种硒化合物中的硒含量分别为（90.24±1.46）、（41.42±1.02）mg/kg和（135.87±1.81）mg/kg（图2B）。由以上数据计算可知，各形态硒在SePEP中的相对含量为SeCys2（31.91±0.51）%、MeSeCys（14.65±0.36）%和SeMet（48.04±0.64）%（图2C）。
2、SePEP氨基酸的种类与含量
氨基酸种类与含量是评价蛋白质营养价值的重要指标。SePEP及PEP的氨基酸组成与含量见表1，两种蛋白中均检测到17 种氨基酸，且SePEP中大部分氨基酸含量显著高于PEP（P＜0.05）。根据联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）提出的理想模式，必需氨基酸（EAA）/总氨基酸（TAA）比值为0.4左右，EAA/非必需氨基酸（NEAA）比值大于0.6，则该种蛋白质品质较好。因此，SePEP与PEP均具有合理的氨基酸组成。
3、SePEP的结构表征
由图3可知，SePEP二级结构由（25.00±1.60）%（相对含量，下同）α-螺旋、（37.48±1.37）% β-折叠、（23.67±1.41）% β-转角和（13.85±1.66）%无规卷曲组成；PEP二级结构则由（20.30±0.87）% α-螺旋、（35.88±0.73）% β-折叠、（24.92±0.92）% β-转角及（20.38±0.84）%无规卷曲组成。相较于PEP，SePEP中α-螺旋结构相对含量显著增多（P＜0.05），无规卷曲结构相对含量显著减少（P＜0.05）。研究发现，硒的添加会导致糙米蛋白中β-折叠与无规卷曲结构相对含量增多，β-转角与α-螺旋结构相对含量减少；随外源硒浓度增加，秀珍菇富硒蛋白的α-螺旋与无规卷曲结构相对含量先增多后减少。
根据表2可知，SePEP总巯基及二硫键含量显著高于PEP（P＜0.05），游离巯基含量无显著差异（P＞0.05）。硒的生物强化导致PEP总巯基与二硫键含量增加，与花生富硒蛋白测定结果一致。蛋白质分子的表面疏水性反映了三级结构的展开程度、表面疏水基团数量及分子间相互作用的强弱。以溴酚蓝结合量表征蛋白的表面疏水性，溴酚蓝结合量越高则说明表面疏水性越高。SePEP与PEP的溴酚蓝结合量分别为（80.59±4.06）μg和（20.33±3.55）μg，SePEP表面疏水性较PEP显著增加（P＜0.05）。这是由于硒与蛋白质结合改变了蛋白质内部环境，导致埋藏在蛋白分子内部的疏水基团暴露，引起表面疏水性增加。综上所述，外源硒的添加显著改变了PEP的结构，但硒对蛋白结构特性影响的具体机制还需深入研究。
4、Pb2+及SePEP消化产物对RAW264.7巨噬细胞作用浓度的筛选分析
不同浓度Pb2+溶液对RAW264.7细胞活力影响（作用时间12 h）如图4A所示，当Pb2+浓度在0～100 μmol/L范围内时，与对照组（0 μmol/L Pb2+溶液）相比，细胞存活率未显著变化（P＜0.05），说明在此浓度范围内Pb2+溶液对RAW264.7细胞无显著毒性。随Pb2+浓度继续升高，细胞存活率逐渐降低，呈剂量依赖性。当Pb2+浓度为800 μmol/L时，细胞存活率仅为（53.48±6.49）%，与对照组相比显著下降了46.52%（P＜0.05），表明该浓度下的Pb2+具有较强的细胞毒性。
将不同质量浓度SePEP及PEP消化产物溶液作用于RAW264.7细胞12 h，细胞存活率结果见图4B。PEP消化产物质量浓度为0～100 μg/mL时细胞存活率无显著差异（P＜0.05），说明该浓度范围内PEP消化产物对RAW264.7细胞未产生毒性。质量浓度0～75 μg/mL范围内的SePEP消化产物对RAW264.7细胞未表现出毒性作用。当SePEP消化产物质量浓度为100 μg/mL时，细胞活力降低至（86.37±6.79）%，与对照组（0 μg/mL蛋白消化产物）相比有显著差异（P＜0.05），这是因为硒的营养必需剂量与毒性剂量之间的范围非常窄，摄入适量的硒于机体有益，硒摄入过量则会造成硒中毒，引起呼吸困难、腹痛、腹泻，甚至死亡，100 μg/mL的SePEP消化产物作用时可能对细胞产生了低毒性作用。因此，后续实验选择5、25、75 μg/mL作为蛋白消化产物作用质量浓度。
5、SePEP消化产物对Pb2+细胞毒性的影响
当Pb2+浓度为800 μmol/L，不添加蛋白消化产物时，RAW264.7细胞存活率接近50%，可作为衡量Pb2+溶液对细胞毒性的指标。以质量浓度为5、25、75 μg/mL的SePEP或PEP消化产物与800 μmol/L Pb2+溶液共处理细胞12 h，细胞存活率变化如图5A所示。与Pb2+处理组相比，不同质量浓度的PEP消化产物对Pb2+细胞毒性无显著影响（P＜0.05），表明PEP消化产物对Pb2+诱导的细胞毒性无缓解作用。SePEP消化产物与Pb2+共处理组中，细胞存活率与消化产物质量浓度呈正相关，呈剂量依赖性。在SePEP消化产物质量浓度为75 μg/mL时，细胞存活率为（76.95±6.95）%，与Pb2+处理组相比细胞存活率显著提高（P＜0.05）。
6、SePEP消化产物对Pb2+诱导RAW264.7细胞因子分泌水平的影响
由图6A可知，5、25、75 μg/mL SePEP或PEP消化产物与100 μmol/L Pb2+溶液共处理对RAW264.7细胞存活率均无显著影响（P＜0.05）。因此，上述条件下细胞存活率一致，细胞因子分泌水平仅受细胞炎症反应状态影响，故所选Pb2+浓度可用于无细胞毒性条件下细胞因子分泌水平差异的分析。与0 μmol/L Pb2+溶液处理组相比，Pb2+处理使细胞培养液中3 种促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α质量浓度显著升高（P＜0.05），分别为（79.79±10.80）、（108.58±6.54）、（76.08±5.62）ng/L，说明细胞已产生炎症反应。与Pb2+处理组相比，添加PEP消化产物共处理对3 种促炎因子的分泌量整体上无显著影响（P＞0.05）；而SePEP消化产物的添加促使IL-6、IL-8及TNF-α质量浓度整体上显著下降（P＜0.05），且呈剂量依赖性，其中IL-8质量浓度在SePEP消化产物质量浓度为75 μg/nL时显著降低至（65.87±6.54）ng/L（P＜0.05）。RAW264.7细胞受外物刺激分泌大量炎症因子，包括IL-6、IL-8与TNF-α等，被广泛应用于建立细胞炎症模型。IL-6与TNF-α和IL-1家族相似，具有促炎特性，在介导炎症中起重要作用，释放水平过高可致细胞死亡。IL-8是一种多细胞来源的趋化因子，可通过聚集中性粒细胞增强炎症反应，间接创造利于肿瘤生长的微环境。抑制促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α的释放可以抑制炎症相关信号通路如NF-κB、MAPK通路的激活，从而减轻炎症反应及炎症过程中的组织损伤。已有研究表明Se可显著抑制Pb2+暴露引起的细胞炎症，如向Pb2+暴露的RAW264.7细胞中添加大米富硒蛋白水解物可显著抑制促炎因子IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α及髓样分化因子88（MyD88）的释放（P＜0.05）；单独以醋酸铅饲喂鸡会显著提高鸡血淋巴细胞中IL-6、IL-8和TNF-α因子mRNA表达水平，亚硒酸钠和醋酸铅联合饲喂时促炎因子表达水平受到显著抑制。本实验中SePEP消化产物对Pb2+诱导的RAW264.7细胞促炎因子释放有显著抑制作用，PEP消化产物对Pb2+诱导的促炎因子释放无明显影响。结果表明，与PEP消化产物相比，SePEP消化产物对Pb2+引起的RAW264.7细胞炎症反应有显著缓解作用（P＜0.05）。
结 论
本实验发现SePEP硒含量为（360.64±3.11）mg/kg，其硒形态主要包括SeMet（（48.04±0.64）%（相对含量，下同））、SeCys 2 （（31.91±0.51）%）及MeSeCys（（14.65±0.36）%）。硒生物强化显著改变了蛋白的营养结构特性，与PEP相比，SePEP氨基酸含量显著增加，α-螺旋结构相对含量增多，无规卷曲结构相对含量减少，总巯基与二硫键的含量增加，蛋白表面疏水性提高。此外，SePEP体外模拟消化产物可显著降低Pb2+对RAW264.7细胞毒性，细胞存活率可由（53.48±6.49）%升高至（76.95±6.95）%。SePEP消化产物对Pb2+暴露RAW264.7细胞的促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的释放具有显著抑制作用，缓解了Pb2+诱导的RAW264.7细胞炎症反应。综上，SePEP可作为膳食硒补充剂满足人群补硒需求，并且可作为一种改善铅毒性的新型膳食硒源。
通信作者简介
胡秋辉，国家食用菌产业技术体系加工研究室主任，南京农业大学/南京财经大学二级教授/博导。针对不同食用菌基础加工物性和品质劣变规律差异，研究创制了真空低温脱水技术、超声渗透组合脱水技术、复合酶解-美拉德提鲜增香精准控制技术、功能成分高效制备与稳态化技术、功能成分多维指纹图谱快速识别技术、真空微波-冷冻干燥技术、挤压预糊化交联技术、物理场耦合酶解破壁提取技术等新型食用菌分类加工技术，并开发出即食类、主食类及功能类食用菌新型健康食品，促进了食用菌产业从“鲜食烹饪”向“即食快消”多元化分类加工模式的转型升级。先后主持国家重点研发计划“战略性国际科技创新合作”重点专项项目、国家自然科学基金、“十三五”国家重点研发计划子课题、农业部948项目、江苏省现代农业重点项目等多项课题。食用菌精深加工关键技术创新与应用获2019年江苏省科学技术进步一等奖（第一完成人）、”经、管、法”深度融合的食品科学与工程专业人才培养模式的创新及实践获2017年江苏省教学成果一等奖（第一完成人）、海洋生物功能性成分高效制备技术与应用获得2014年教育部优秀成果类科技进步二等奖（第一完成人）,担任《Food Science and Human Wellness》杂志编委。相关成果发表论文200余篇，2017-2021年连续入选Elsevier中国农业和生物科学领域高被引学者榜单，授权发明专利30余项。
本文《杏鲍菇富硒蛋白的营养结构特性及对铅毒性的缓解作用》来源于《食品科学》2022年43卷15期125-133页，作者：张雪莉，胡秋辉，纪阳，俞安淇，仲磊，赵立艳，范育明。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220120-207。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于 2022年12月3-4日 在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。
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