南京中医药大学研究生，南京中医药大学研究生院
人工骨膜已成为一种新 的骨愈合策略。 人们已经在努力开发具有良好成骨和血管生成性能的新型骨膜 替代品。 然而，骨膜替代品在移植中的临床应用受到材料难以获得、 复杂的制备工艺和严格的储存条件的限制。 据报道，植入 式生物材料可引起机体的免疫反应，如过敏、疼痛或异物感，增加患者生理和心理上的负担。 为 了骨缺损愈合，创造具有良好成骨活性、生物降解性和生物安全性的人工骨膜至关重要。 近日，南京中医药大学吴皓教授团队在 Advanced Functional Materials 上发表了题为“Cuttleb one-Derived Or ganic Matrix: A Facile Periosteum Substitute for Bone Regeneration”的研究性论文。吴皓教授和刘睿教授为共同通讯作者，韦源青博士为文章的第一作者兼通讯作者，硕士研究生琚苗苗为共同第一作者。该研究将乌贼骨有机质膜作为一种易于获得的人工骨膜，具有良好的生物活性、生物降解性和生物安全性。
乌贼骨有机质膜表征
刻蚀乌贼骨中的碳酸钙得到乌贼骨有机质膜（CDOM），根据CDOM的宏观图像和SEM的表征，膜具有相似的表面形貌，顶部有“S”向凹槽，相邻隔柱之间的距离为87±12 µm，为细胞增殖提供了一个合适的区域。膜的反面比正面更光滑，而且两侧均有纳米孔，可供小分子运输。FTIR光谱分析证实，多糖和蛋白质是CDOM的主要成分。膜表面的“S”型凹槽增加了CDOM膜的粗糙度，改善了亲水性，更有利于愈合过程中细胞的黏附。由于多糖和蛋白质赋予CDOM生物降解能力，CDOM的力学性能相对较弱。
（图1. CDOM的表征）
生物相容性
研究者对CDOM的生物相容性进行了评价。将rBMSCs和HUVEC细胞接种在CDOM表面，评价CDOM对细胞存活、黏附和增殖的影响。活死染色结果显示各组细胞存活率良好，表明CDOM无细胞毒性。从骨架染色来看，在CDOM-EDTA表面生长的细胞有伪足状的触角，贴附牢固，细胞形态良好，细胞扩散面积更大。CCK-8实验结果表明，各组CDOM均可以促进rBMSCs和HUVEC细胞增殖。由此可见，CDOM具有较高的生物相容性，可为骨愈合提供了一个良好的仿生微环境。
（图2. CDOM的生物相容性）
体外成骨成血管活性评价
接下来，研究者对CDOM在体外促成骨和促血管生成的作用进行了评估。结果表明CDOM可以增强rBMSCs细胞在成骨过程中ALP活性。诱导21天后，相对于对照组，各组CDOM出现大量矿化结节，表明CDOM膜具有良好的促成骨分化能力。成骨相关基因（Col-I、Runx2、OPN和OCN）表达水平的上调和成骨相关蛋白水平增加进一步证实了这一结论。此外，采用体外血管生成实验来评估CDOM的促血管生成能力。培养6小时后，所有CDOM组均观察到清晰的网状血管结构。VEGF蛋白表达增加进一步证明CDOM具有良好的体外成血管活性。
体外成骨成血管评价显示CDOM具有良好的的生物活性，因此进一步探究了CDOM促成骨成血管的可能机制。PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路在骨愈合和骨重建中具有重要作用。与其他组相比，CDOM-EDTA组中p-ERK/ERK的蛋白表达率显著增加，与此同时，p-PI3K/PI3K和p-Akt/ Akt的蛋白表达率也显著增加，当受到外部信号的刺激时，ERK被磷酸化以激活成骨主转录因子Runx2，从而上调成骨标志物，PI3K和Akt被磷酸化以激活VEGF，与血管形成以及内皮细胞的迁移和增殖相关。因此，作者推测CDOM-EDTA通过激活MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路来促进成骨和血管生成。MAPK/ERK信号通路的激活可能与CDOM表面结构以及CDOM膜中降解的活性肽有关。
（图3. CDOM体外成骨成血管活性评价）
体内成骨成血管活性评价
研究者选用临界大小的大鼠颅骨缺损模型来评估CDOM的体内治疗效果。植入4周和8周后，CDOM-EDTA组的新骨面积明显大于对照组，骨密度（BMD）和骨组织体积/总组织体积（BV/TV）值与对照组相比也具有显著性差异，这意味着CDOM-EDTA特殊的表面微结构及其主要成分可以促进骨愈合。H&E染色和Masson三色染色结果显示，与其他组相比，CDOM-EDTA组在术后4周和8周的新骨结构数量最多，纤维结缔组织数量最少，成骨量最大。骨缺损部位的OCN、α-SMA免疫荧光染色进一步肯定了CDOM的成骨成血管活性。
（图4. CDOM的体内骨再生性能评价）
（图5. CDOM的体内骨再生性能评价）
（图6. CDOM体内成骨和血管生成作用）
总结
该研究设计了新的骨膜替代品，并评价了其生物活性和生物安全性。通过从乌贼骨中蚀刻碳酸钙，制备了CDOM。CDOM由多糖和蛋白质组成，在结构上具有“S”型的凹槽，具有促进成骨和血管生成的作用。尽管CDOM在机械性能方面存在局限性，但其生物降解性和生物安全性使其成为骨缺损再生临床应用的良好候选材料。
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原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202214095
来源：高分子科学前沿
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南京中医药大学研究生(南京中医药大学研究生院)